Transformation

Plasmider kan transformera in i Escherichia coli genom att man först gör bakterierna kompetenta med kalciumklorid och sedan ger dem en snabb värmeschock vid 42^oC. Då tar en liten andel av bakterierna upp plasmid. Dessa kan man sedan selektera ut genom att odla dem på agarplattor med antibiotika. Då växer endast de bakterier som erhållit antibiotikaresistens genom att ta upp plasmid.
Material	E coli RR1 på agarplatta utan pencillin plasmidlösning, t ex pUC, konc 25 – 40 ng/µl LB-medium, sterilt, minst 75 ml LB-agarplattor med ampiccillin, 20 st LB-agarplattor utan pencillin, 5 st steril kalciumkloridlösning, 100 mmol/l, 40 ml sterila platinöser och racklor sterila centrifugrör med lock, 8 st sterila eppendorfrör 5 st sterila mätpipetter, 10 ml automatpipetter 5 – 100 µl med sterila spetsar is centrifug som kan köra ca 3000 varv/min värmeskåp 37^oC gärna även termostaterat skakvattenbad, 37^oC
Utförande	Punkterna 1 – 4 nedan gäller för hela lab-gruppen Punkterna 5 – 11 gäller för varje liten lab-grupp (oftast 2 personer)
För över ca 5 resp 10 ml LB-medium till var sitt sterilt rör. Använd röret med 5 ml til förkultur, spara det andra i kyl till nästa dag. Förkultur: Ta med steril platinös några kolonier E coli RR1 och ympa i 5 ml LB-medium i ett sterilt rör. Låt dem växa i 37^oC över natten , helst med skak. Nästa dag: Kontrollera att förkulturen blivit rejält grumlig. Häll ner den i 50 ml LB-medium i 100 ml steril kolv eller flaska. Låt det växa i 37^oC, helst med skak i 1 – 2 tim Ställ kalciumkloridlösningen på is under tiden. Kontrollera att bakteriekulturen fått en viss grumlighet. Mät ev dess absorbans vid 550 nm i spektrofotometer. Den bör ligga mellan 0,4-0,7 absorbansenheter. Ställ då bakterierna på is i 10 min. Skaka upp bakterierna. Varje lab-grupp tar 10 ml bakteriekultur i ett sterilt centrifugrör. Bakteierna centrifugeras 3000 varv /min i 5 min. Häll därefter av supernatanten i en kolv. Slamma upp bakterierna i den lilla volym vätska som finns kvar genom att knacka på röret. Tillsätt sedan 5 ml iskall kalciumkloridlösning till bakteriesuspensionen och slamma upp i hela volymen. Låt stå på is i 30 min. De kan även sparas i kylskåp till nästa Centrifugera ner bakterierna på samma sätt som förut. Häll av supernatanten i samma kolv. Slamma upp bakterierna och tillsätt sedan 1 ml iskall kalciumkloridlösning. Låt bakterierna stå kvar på is. De är nu kompetenta och kan användas direkt för transformation Transformation: För över 200 µl kompetenta bakterier till ett sterilt eppendorfrör. Tillsätt 10 µl plasmidlösning. Låt bakterierna stå på i s minst 30 min. Ställ under tiden in ett vattenbad på 42^oC. Värmechocka bakterierna i 42^oC i 90 sek. Ställ dem därefter direkt på is igen. Tillsätt 800 µl sterilt LB-medium till de värmechockade bakterierna. Sätt dem i 37^oC i 45 min. För hela gruppen: Lägg in agarosplattorna i 37^oC värmeskåp Ta fram 3 (ev 4) LB-agarplattor med ampicillin och 1 LB-agarplatta utan ampicillin per grupp om två personer. Pipettera ut följande: - Amp-platta 1: 75 µl bakterier från punkt 9. Rackla ut dem jämnt. - Amp-platta 2: 40 µl från punkt 9 och 35 µl sterilt medium. Rackla ut jämnt. - Amp.platta 3: 5 µl bakterier från punkt 9 och 70 µl sterilt medium. Rackla ut jämnt - (Amp-platta 4: 75 µl bakterier från punkt 4. Rackla ut jämnt.) - Platta utan apicillin: 5 µl bakterier från punkt 9 och 70 µl sterilt LB-medium. Rackla ut jämnt. När all vätska absorberats av agarn, vänd plattorna upp och ner, skriv på med tuschpenna hur mycket bakterier som tillsatts. Sätt sedan in plattorna i värmeskåp 37^oC. Låt dem stå där över natten. Nästa dag: Studera tillväxten på plattorna och jämför resultaten.
Efter laborationerna: Autoklavera alla bakterierester, supernatanten från centrifugeringarna, alla kärl, spetsar mm, som använts till bakterier. Torka av alla bänkytor med desinfektionsmedel Tvätta häderna OBSERVERA: Tillstånd från Arbetsmiljöverket att arbeta med genetiskt modifierade mikroorganismer (GMM) krävs för att få transformera in rekombinanta plasmider i bakterier. Information och blanketter finns på arbetsmiljöverkets hemsida www.amv.se