© Biokomp i Göteborg AB

Molekylernas egenskaper framgår av tabellen nedan.

Molmassa g/mol

 Laddning vid pH 7

 - affinitetsmedium, Affi-blue, som i buffert A binder albumin

Provlösning:           albumin 25 mg/ml, blå dextran 5 mg/ml,
                             cytokrom c 2 mg/ml och DNP-glycin 2,5 mg/ml    
                             lösta i 0,02 M fosfatbuffert pH 7,0

Buffertar:

B: buffert A med tillsats av fast NaCl till en konc av 1,4 mol/l

D: 2 M tris, pH>10

Utförande:

Fäst  hållaren av plast vågrätt i ett stativ och sätt i de tre kolonnerna.
Plocka bort locket och den nedre ”pluggen”. 
Eftersom kolonnerna levereras med överskott av buffert A, låter man först detta rinna ut (vätskan slutar att rinna ut då pelarens yta torrläggs).

Sätt 0,5 ml provlösning på CM-Sepharose-pelaren och låt den  tränga in i pelaren. 
Sätt ca 0,5 ml buffert A på pelaren och låt den tränga in. 
Börja samla upp eluatet efter den tredje blå droppen. 
Sätt på ytterligare 2 ml buffert A och fortsätt samla eluatet i samma rör som tidigare upp till 1 ml. 
Fortsätt samla ca 1 ml fraktioner tills eluatet är ofärgat. Cytokrom c sitter kvar på pelaren medan de övriga föreningarna har eluerats ut. 

Välj ut den fraktion, som har starkast färg för att sätta på Affi-blue pelaren. 

Cytokrom c elueras genom att sätta lösning D (Tris-lösningen).

Sätt på den starkast färgade 1 ml fraktionen från jonbyteskromatografin på Affi-blue-pelaren. 
Sätt ca 1 ml buffert A droppvis på pelaren och låt det tränga in. 
Tillsätt mer buffert A och samla upp eluatet i 1 ml fraktioner tills eluatet är ofärgat. Det är viktigt att eluerings-hastigheten inte är för snabb, då kan resultatet bli att albumin fäster dåligt och det blir problem att påvisa albumin i eluatet när pelarmassan senare elueras. Albumin binds till Affi-blue-massan, medan de övriga två föreningarna elueras ut i de första 4 - 5 fraktionerna. Välj ut den fraktion som har starkast (grön) färg för att sätta på gelfiltreringsmassan.  

Eluera ut albuminet genom att tillsätta buffert B (fosfatbuffert med NaCl) till Affi-blue pelaren och samla upp  10 st 0,5 ml fraktioner  
OBS!  Det krävs en mycket långsam elueringshastighet för att albuminet ska släppa från Affigel-massan. Detta kan åstadkommas genom att man tillsätter elueringsbuffert droppvis med hjälp av pastörpipett på pelaren.
Tillsätt 0,5 ml ninhydrinlösning till samtliga rör och och koka i 5-10 min. (Obs stick hål på eppendorfrörets lock före kokningen) Notera färgförändringen.
Sätt på 0,5 ml av den gröna fraktionen från affinitetskromatografin på Sephadexpelaren och låt det tränga in i pelaren. Sätt ca 1 ml av buffert A på pelaren och låt det tränga in. Tillsätt mer buffert A och samla upp eluatet i 1 ml fraktioner tills eluatet är ofärgat.Notera färgseparationen på pelaren.

                         Dextran blue elueras ut först och därefter DNP-glycin. 

  
Regenerering: 
CM-sepharose:   Ca 40 ml av buffert A får långsamt rinna igenom pelaren 
Affi-blue:             Ca 10 ml av buffert C (buffert A med tillsats av urea) får långsamt rinna igenom pelaren.   
                           Låt sedan 10 ml av buffert A rinna igenom.   
Gelfiltrering:         Tvätta med buffert A tills pelarmassan är helt färglös.  
Vid långtidsförvaring av kolonnerna kan man tillsätta NaN_3, natriumazid  (gift!), till en konc av  0,05% till buffert A för att förhindra bakterietillväxt.