Hem

KLYVNING AV l-DNA MED RESTRIKTIONSENZYM

Målgrupp Experimentet är lämpligt på gymnasiet och kan göras i grupp eller ingå i ett specialarbete
Säkerhet

 Laborationen innehåller ett moment med hantering av lösning innehållande etidiumbromid (EtBr), som är mutagen.

Engångshandskar används som personligt skydd.

Skyddspapper bör användas på bänkytor där EtBr-lösning hanteras.
Kärl, som har innehållit utspädda lösningar av EtBr får rengöras under rinnande vatten.
Handskar, skyddspapper och annat engångsmaterial, som varit i kontakt med EtBr läggs i en plastpåse, som försluts och läggs bland sopor som går till förbränning.
EtBr sönderfaller vid förbränningentill ofarliga produkter.
Observera! Vid arbete med DNA måste man vara försiktig, så att inte lösningarna kontamineras med enzymet DNas som bryter ner DNA. Använd handskar och vidrör aldrig pipettspetsar, rör med stamlösningar av DNA eller enzymlösningar direkt med händerna. (DNas finns på våra händer)

Enzymer förvaras i –20oC och hålls på is eller i kylblock då man pipetterar upp enzymet. De ställs omedelbart tillbaka i frys efter användandet

Material Elektroforesapparat för submarin elektrofores
Likspänningsaggregat
Automatpipetter (1 ml - 10 ml) med spetsar
Eppendorfrör 1,5 ml med lock och ställ för dessa
Termostaterat vattenbad 37oC
Flytbrygga för eppendorfrör
UV-lampa med våglängd 254, 302 eller 365 nm
Märkpennor med smal spets (ej vattenlöslig skrift)
Kärl för "infärgning" av DNA i gelen
Engångshandskar
Is
Kemikalier
l-DNA Restriktionsenzym med klyvningsbuffert Sterilt vatten
Tris Borsyra EDTA
Agaros Etidiumbromidlösning 5mg/ml
Glycerol Bromfenolblått
Utförande Följande lösningar behövs:
Elektroforesbuffert (= TBE-buffert)
Stamlösning: 27 g Tris + 13,5 g Borsyra + 2,3 g EDTA löses i 0,5 l vatten Brukslösning: Späd stamlösningen 10 ggr.

BFB-lösning: Lös 50 mg bromfenolblått i 20 ml 50%-ig glycerol

Etidiumbromidlösning: 5 mg/ml vatten

"Framkallningslösning" för DNA:
Tillsätt 10ml Etidiumbromidlösning till 100 ml brukslösning TBE-buffert

l-DNA-lösning: konc l-DNA = 0,25 mg/ml
l-DNA-referenslösning: konc l-DNA = 0,080 mg/ml

Restriktionsenzym (ca 10U/ml) + klyvningsbuffert

Klyvningsreaktion
  • Märk ett eppendorfrör med det enzym du ska använda
  • Tillsätt 13 ml vatten
  • Tillsätt 4 ml l-DNA-lösning ( = 1000 ng)
  • Tillsätt 2 ml klyvningsbuffert
  • Tillsätt 1 ml restriktionsenzym

Den totala volymen på klyvningsblandningen är 20 ml.
Koncentrationen klyvd l-DNA är 50 ng/ml

Stäng locket och centrifugera röret några sekunder så att dropparna samlas i botten av röret.
Ställ röret i vattenbad 37oC i 1 timma.

 

Gjutning av gel till submarin gelelektrofores

Kemikalier

Agaros för separation av nukleinsyras

TBE-buffert: stamlösning (27g Tris+13,5g borsyra+2,3g EDTA i 1 l vatten)
späds 10 ggr före användande

Utförande
Späd stamlösningen av TBE-buffert 10 ggr. Tänk på att göra så mycket att det räcker till gelgjutning och till elektroforeskärlet.

För gelformar utan speciell gjutform: Tejpa gelformens kortsidor med tejp, gärna dokumenttejp. Gör gärna ett litet "öra" att dra i för att underlätta borttagandet av tejpen.

Lägg gelformen på ett absolut vågrätt underlag.

Väg upp agaros till 0,7% agaroslösning i en 200 ml E-kolv. Tillsätt brukslösning TBE-buffert, markera vätske-nivån.Värm lösningen i mikrovågsugn tills den är alldeles glasklar. Låt den svalna till ca 60oC, justera ev vätskenivån. Häll gelen i gelformen till 4-5 mm höjd. Ta bort ev luftblåsor med pasteurpipett och sätt ner en eller två kammar för provbrunnsformning, innan agarosen stelnat.

 

När agarosen stelnat (efter ca 15-20 min), tas tejpen bort och gelformen läggs i elektroforesapparaten.
Ta bort kammen eller kammarna försiktigt.
Elektroforesbuffert hälls på så mycket att den står 1-2 mm över gelytan.

Laddning av proverna i gelen

BFB-lösning:
Lös 50 mg bromfenolblått
i 20 ml 50%-ig glycerol		 Proverna behöver innehålla en tung vätska och något färgämne, som vandrar fortare än DNA-proverna.
Till provet sätts 1/4 volym BFB-lösning
Brunnarna i gelen rymmer 10 - 20 ml, beroende på kammens tänder och gelens tjocklek.

Synliggörande av DNA i gelen med etidiumbromid

Både gel och elektroforesbuffert används utan etidiumbromid. Efter avslutad elektrofores läggs gelen i en plastlåda med brukslösning av TBE-buffert innehållande etidiumbromid. Lämplig koncentration av etidiumbromid i framkallningsbad är 0,5 mg/ml (OBS! Handskar!) Gelen får ligga där 10-20 min. Därefter framträder DNA-banden vid UV-belysning.

Dekontaminering av etidiumbromidinnehållande lösningar

Alternativ infärgning (med lägre känslighet)

Synliggörande av DNA i gelen med metylenblått
Efter elektrofores läggs gelen i en plastlåda med 0,025% metylenblåttlösning 20-30 min.
Skölj gelen försiktigt under rinnande vatten och fortsätt avfärgningen tills banden framträder.
Titta på gelen på overheadapparat eller annat ljusbord.
Fördelen med denna metod är att man slipper hantera den mutagena etidiumbromiden.

Den klyvningsblandning (12 ml) som finns kvar i eppendorfröret kan långtidsförvaras i frys -20oC. För att inaktivera restriktionsenzymet kan man lämpligen först upphetta blandningen till 70oC under 15 min.

 

Ó biokomp, Solveig Björk