ã biokomp                                                                                                       Hem

KLYVNING AV pUC-PLASMID OCH l-DNA MED RESTRIKTIONSENZYM

Målgrupp Experimentet är lämpligt på gymnasiet och kan göras i grupp eller ingå i ett specialarbete. Introduktion
Säkerhet

 Laborationen innehåller ett moment med hantering av lösning innehållande etidiumbromid (EtBr), som är mutagen.

Engångshandskar används som personligt skydd.

Skyddspapper bör användas på bänkytor där EtBr-lösning hanteras.
Kärl, som har innehållit utspädda lösningar av EtBr får rengöras under rinnande vatten.
Handskar, skyddspapper och annat engångsmaterial, som varit i kontakt med EtBr läggs i en plastpåse, som försluts och läggs bland sopor som går till förbränning.
EtBr sönderfaller vid förbränningen till ofarliga produkter.
Observera! Vid arbete med DNA måste man vara försiktig, så att inte lösningarna kontamineras med enzymet DNas som bryter ner DNA. Använd handskar och vidrör aldrig pipettspetsar, rör med stamlösningar av DNA eller enzymlösningar direkt med händerna. (DNas finns på våra händer)

Enzymer förvaras i –20oC och hålls på is eller i kylblock då man pipetterar upp enzymet. De ställs omedelbart tillbaka i frys efter användandet


Material Elektroforesapparat för submarin elektrofores
Likspänningsaggregat
Automatpipetter (1 ml - 10 ml) med spetsar
Eppendorfrör 1,5 ml med lock och ställ för dessa
Termostaterat vattenbad 37oC
Flytbrygga för eppendorfrör
UV-lampa med våglängd 254, 302 eller 365 nm
Märkpennor med smal spets (ej vattenlöslig skrift)
Kärl för "infärgning" av DNA i gelen
Engångshandskar
Is

Kemikalier
l-DNA (frystorkat) Restriktionsenzym i klyvningsbuffert (frystorkat)
Tris Borsyra Sterilt vatten
Agaros Etidiumbromidlösning 5mg/ml EDTA
Glycerol Bromfenolblått
Utförande Följande lösningar behövs:
Elektroforesbuffert (= TBE-buffert)
Stamlösning: 27 g Tris + 13,5 g Borsyra + 2,3 g EDTA löses i 0,5 l vatten
Brukslösning: Späd stamlösningen 10 ggr.

BFB-lösning: Lös 50 mg bromfenolblått i 20 ml 50%-ig glycerol

Etidiumbromidlösning: 5 mg/ml vatten

"Framkallningslösning" för DNA:
Tillsätt 10ml Etidiumbromidlösning till 100 ml brukslösning TBE-buffert

l-DNA-lösning: konc l-DNA = 0,25 mg/ml får man när man löser upp det frystorkade DNA:t (10 mg) i 40 ml sterilt vatten
Späd 3 ml av l-DNA-lösningen (0,25 mg/ml) med 7 ml sterilt vatten så får du
l-DNA-referenslösning: konc l-DNA = 0,075 mg/ml  
plasmid DNA, pUC: konc pUC = 0,20 mg/ml

Restriktionsenzym (ca 10U/ml) i klyvningsbuffert (frystorkat)
Klyvningsreaktion
  • Sätt 5 ml l-DNA-lösning (1250 ng) i ett eppendorfrör. Märk röret.
  • Sätt 5 ml pUC-plasmidlösning (1000ng) i ett eppendorfrör. Märk röret.
  • Lös noga upp det frystorkade restriktionsenzymet genom att tillsätta 10 ml vatten.
  • Fördela enzymlösningen lika i de två rören med DNA.

Stäng locken och centrifugera rören några sekunder så att dropparna samlas i botten av röret.
Ställ röret i vattenbad 37oC i 40 - 60 min.

 

 lamba.jpg (15189 bytes)

Resutatet av klyvningen kontrolleras på agarosgel. Man jämför då bandmönstret i gelen för klyvda och oklyvda DNA-lösningar. OBS! Endast en del av klyvningsblandningen används för kontroll. Resten sparas och används vid ligeringen.

Elektrofores  
                            Gjutning av gel till submarin gelelektrofores

Kemikalier

 

 

 Agaros för separation av nukleinsyra
TBE-buffert: stamlösning (27g Tris+13,5g borsyra+2,3g EDTA i 1 l vatten)
späds 10 ggr före användande
Utförande

 

 

 

 Späd stamlösningen av TBE-buffert 10 ggr. Tänk på att göra så mycket att det räcker till gelgjutning och till elektroforeskärlet.

För gelformar utan speciell gjutform: Tejpa gelformens kortsidor med tejp, gärna dokumenttejp. Gör gärna ett litet "öra" att dra i för att underlätta borttagandet av tejpen.

Lägg gelformen på ett absolut vågrätt underlag.

Väg upp agaros till 0,7% agaroslösning i en 200 ml E-kolv. Tillsätt brukslösning TBE-buffert, markera vätskenivån.Värm lösningen i mikrovågsugn tills den är alldeles glasklar. Låt den svalna till ca 60oC, justera ev vätskenivån. Häll gelen i gelformen till 4-5 mm höjd. Ta bort ev luftblåsor med pasteurpipett och sätt ner en eller två kammar för provbrunnsformning, innan agarosen stelnat.

 

När agarosen stelnat (efter ca 15-20 min), tas tejpen bort och gelformen läggs i elektroforesapparaten.
Ta bort kammen eller kammarna försiktigt.
Elektroforesbuffert hälls på så mycket att den står 1-2 mm över gelytan.


Laddning av proverna i gelen

BFB-lösning:
Lös 50 mg bromfenolblått
i 20 ml 50%-ig glycerol		 Proverna behöver innehålla en tung vätska och något färgämne, som vandrar fortare än DNA-proverna.
Till provet sätts 1/4 volym BFB-lösning
Brunnarna i gelen rymmer 10 - 20 ml, beroende på kammens tänder och gelens tjocklek.

gel4 b.gif (45255 bytes)

Synliggörande av DNA i gelen med etidiumbromid
Både gel och elektroforesbuffert används utan etidiumbromid. Efter avslutad elektrofores läggs gelen i en plastlåda med brukslösning av TBE-buffert innehållande etidiumbromid. Lämplig koncentration av etidiumbromid i framkallningsbad är 0,5 mg/ml (OBS! Handskar!) Gelen får ligga där 10-20 min. Därefter framträder DNA-banden vid UV-belysning.

 

 

Dekontaminering av etidiumbromidinnehållande lösningar

 

Alternativ infärgning (med lägre känslighet)

Synliggörande av DNA i gelen med metylenblått
Efter elektrofores läggs gelen i en plastlåda med 0,025% metylenblåttlösning 20-30 min.
Skölj gelen försiktigt under rinnande vatten och fortsätt avfärgningen tills banden framträder.
Titta på gelen på overheadapparat eller annat ljusbord.
Fördelen med denna metod är att man slipper hantera den mutagena etidiumbromiden.

De sparade eppendorfrören med klyvt lambda- resp pUC-DNA (7 resp 8 ml) kan långtidsförvaras i frys -20oC. För att inaktivera restriktionsenzymet kan man lämpligen först upphetta blandningen till 70oC under 15 min. 

 

 

LIGERING AV KLYVD l-DNA och KLYVD pUC-PLASMID

Lösningar Klyvd l-DNA och klyvd pUC-plasmid
(klyvda med samma restriktionsenzym)

Frystorkat ligas
Utförande
  • Lös upp det frystorkade ligaset i 5 ml sterilt vatten. Skaka lösningen genom att stöta röret mot bordet några gånger
  • Sätt till det klyvda DNA:t: 7ml (= 825 ng) klyvd l-DNA + 8 ml (=800 ng) klyvd pUC-plasmid
  • Centrifugera lätt i några sekunder så att dropparna samlas i botten av röret
  • Ligera över natt i kylskåp (+4 oC)
    eller under ca 40 min vid 16 oC 
Ligering
Elektrofores
 Kontroll av ligering
  • Blanda 6 ml ligerat DNA +2 ml BFB-glycerol + 2ml vatten
  • Sätt på 10 ml ligeringsreferens: (= 400 ng klyvd l-DNA + 100 ng klyvd pUC + BFB-glycerol ) 
ligeringskontroll.gif (4578 bytes)

Vill man spara det ligerade DNA:t är det lämpligt att inaktivera ligas-enzymet genom att inkubera reaktionsblandningen vid 70oC i 10 min. Frys blandningen om du vill spara den.

 

 

ã Biokomp i Göteborg AB